Untersuchung von Glykosylierungsleistung und intrazellulären Nukleotidzucker-Konzentrationen rekombinanter CHO-Zellen unter hypothermen Kulturbedingungen
Michael Schomberg
Diese Publikation zitieren
Michael Schomberg, Untersuchung von Glykosylierungsleistung und intrazellulären Nukleotidzucker-Konzentrationen rekombinanter CHO-Zellen unter hypothermen Kulturbedingungen (2010), Logos Verlag, Berlin, ISBN: 9783832593513
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Beschreibung / Abstract
Die für die Wirksamkeit rekombinanter Glykoproteine relevanten Zuckerseitenketten
machen die gentechnische Herstellung solcher Biopharmazeutika in Säugerzelllinien
notwendig. Diese besitzen im Gegensatz zu Prokaryoten und einfachen Eukaryoten,
wie z.B. Hefen, die erforderlichen Enzyme zur korrekten Durchführung der Glykosylierung.
Die Biosynthese dieser posttranslationalen Modifikation findet in einem
komplexen Netzwerk verschiedener enzymatischer Reaktionen im Endoplasmatischen
Retikulum und Golgi-Apparat der Zellen statt. Externe Faktoren wie z.B. Substrat-
Konzentrationen oder Prozessparameter können diesen Prozess beeinflussen, was zu
Veränderungen in den Oligosaccharidstrukturen eines Glykoproteins führen kann.
Diese Einflüsse wurden bereits in zahlreichen Studien untersucht (Butler, 2006). Eine
genauere Untersuchung externer Faktoren auf die intrazellulären Vorgänge der
Glykanbiosynthese wurde bisher allerdings nur selten vorgenommen. Daher war es
Ziel dieser Arbeit, die intrazellulären Auswirkungen eines die Glykosylierung beeinflussenden
Prozessparamters auf die hierbei relevanten Metabolite und Enzyme zu
untersuchen.
Hierfür waren die für die Glykanbiosynthese essentiellen Nukleotidzucker zu quantifizieren,
welche als Bausteine der Glykane von verschiedenen Glycosyltransferasen
zu Oligosacchariden verknüpft werden. Des Weiteren sollten die intrazellulären Konzentrationen
der Nukleotide gemessen werden. Sie spielen eine entscheidende Rolle
für die Biosynthese der Nukleotidzucker. Um diese Analyte quantifizieren zu können,
mussten Methoden zur ihrer Extraktion, Präparation und Messung entwickelt
werden.
Neben der Entwicklung geeigneter analytischer Methoden musste ein Prozessparameter
mit Einfluss auf die Glykosylierung ermittelt werden. Zum Auffinden eines
solchen Prozessparameters wurde eine rekombinante CHO-Zelllinie (CHO, engl. Chinese
Hamster Ovary) verwendet, welche das Glykoprotein Erythropoietin exprimierte.
Unter Variation des die Glykosylierung beeinflussenden Prozessparameters sollten
dann in weiteren Kultivierungen die Produktqualität hinsichtlich der Sialylierung und
die Konzentrationen intrazellulärer Nukleotid- und Nukleotidzucker-Konzentrationen
untersucht werden.
machen die gentechnische Herstellung solcher Biopharmazeutika in Säugerzelllinien
notwendig. Diese besitzen im Gegensatz zu Prokaryoten und einfachen Eukaryoten,
wie z.B. Hefen, die erforderlichen Enzyme zur korrekten Durchführung der Glykosylierung.
Die Biosynthese dieser posttranslationalen Modifikation findet in einem
komplexen Netzwerk verschiedener enzymatischer Reaktionen im Endoplasmatischen
Retikulum und Golgi-Apparat der Zellen statt. Externe Faktoren wie z.B. Substrat-
Konzentrationen oder Prozessparameter können diesen Prozess beeinflussen, was zu
Veränderungen in den Oligosaccharidstrukturen eines Glykoproteins führen kann.
Diese Einflüsse wurden bereits in zahlreichen Studien untersucht (Butler, 2006). Eine
genauere Untersuchung externer Faktoren auf die intrazellulären Vorgänge der
Glykanbiosynthese wurde bisher allerdings nur selten vorgenommen. Daher war es
Ziel dieser Arbeit, die intrazellulären Auswirkungen eines die Glykosylierung beeinflussenden
Prozessparamters auf die hierbei relevanten Metabolite und Enzyme zu
untersuchen.
Hierfür waren die für die Glykanbiosynthese essentiellen Nukleotidzucker zu quantifizieren,
welche als Bausteine der Glykane von verschiedenen Glycosyltransferasen
zu Oligosacchariden verknüpft werden. Des Weiteren sollten die intrazellulären Konzentrationen
der Nukleotide gemessen werden. Sie spielen eine entscheidende Rolle
für die Biosynthese der Nukleotidzucker. Um diese Analyte quantifizieren zu können,
mussten Methoden zur ihrer Extraktion, Präparation und Messung entwickelt
werden.
Neben der Entwicklung geeigneter analytischer Methoden musste ein Prozessparameter
mit Einfluss auf die Glykosylierung ermittelt werden. Zum Auffinden eines
solchen Prozessparameters wurde eine rekombinante CHO-Zelllinie (CHO, engl. Chinese
Hamster Ovary) verwendet, welche das Glykoprotein Erythropoietin exprimierte.
Unter Variation des die Glykosylierung beeinflussenden Prozessparameters sollten
dann in weiteren Kultivierungen die Produktqualität hinsichtlich der Sialylierung und
die Konzentrationen intrazellulärer Nukleotid- und Nukleotidzucker-Konzentrationen
untersucht werden.
Inhaltsverzeichnis
- BEGINN
- 1. Theorie 1
- 1.1. Zielsetzung der Arbeit
- 1.2. Einführung
- 1.3. Das Modellglykoprotein Erythropoietin
- 1.4. Biosynthese komplexer N-Glykane
- 1.5. Metabolismus der Nukleotidzucker
- 1.6. Beinflussende Faktoren der Glykosylierung in Zellkulturprozessen
- 2. Material und Methoden
- 2.1. Zellkultivierung
- 2.2. Analytik der Zellkulturprozesse
- 2.3. Analytik der Erythropoietin-Glykosylierung
- 2.4. Präparation und Analyse intrazellulärer aktivierter Zucker und Nukleotide
- 2.5. Methoden zur Untersuchung der Expression von Sialyltransferase
- 3. Ergebnisse und Diskussion
- 3.1. Entwicklung von Methoden zur Messung intrazellulärer Nukleotid- und Nukleotidzucker-Konzentrationen
- 3.2. Kultivierungen zur Untersuchung des Einflusses variierter Temperaturbedingungen
- 3.3. Untersuchung intrazellulärer Metabolite und Enzyme des Glykosylierungsapparats für Parallelkultivierung B und C
- 4. Zusammenfassung und Ausblick
- A. Anhang