Enzymatische Synthese und bioorthogonale Fluoreszenzmarkierung von cyclopropenmodifizierten Oligonukleotiden
Damian Ploschik
Diese Publikation zitieren
Damian Ploschik, Enzymatische Synthese und bioorthogonale Fluoreszenzmarkierung von cyclopropenmodifizierten Oligonukleotiden (2018), Logos Verlag, Berlin, ISBN: 9783832590390
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Beschreibung / Abstract
Die Untersuchung biologischer Systeme stellt einen zentralen Bestandteil vieler wissenschaftlicher Disziplinen, wie der Biologie, Chemie, Pharmazie und den jeweiligen Grenzgebieten dar. Durch die Markierung einzelner Biomoleküle wie Nukleinsäuren oder Proteinen mit Farbstoffen wird die Verwendung optischer Methoden, wie z.B.: der Fluoreszenzmikroskopie möglich. Diese Untersuchungen liefern wichtige Informationen über die Verteilung und den Transport der entsprechenden Biomoleküle.
Zur Modifizierung von z.B.: Nukleinsäuren stehen verschiedene postsynthetische Reaktionen zur Verfügung, wobei in dieser Arbeit, insbesondere auf die Diels-Alder-Reaktion mit inversem Elektronenbedarf (iEDDA) Wert gelegt wird. Besonders die Verwendung von 1-Methylcyclopropenen als reaktive Sonde stellt eine hervorragende Methode zur schnellen und zugleich bioorthogonalen Markierung dar. Diese werden im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit enzymatisch in Oligonukleotide eingebaut und deren Reaktivität mit tetrazinmodifizierten Fluoreszenzfarbstoffen demonstriert. Anschließend werden diese cyclopropenmodifizierten DNA-Stränge zur Untersuchung von Brustkrebszellen (HeLa) genutzt.
Diese Arbeit stellt einige der ersten Anwendungen der 1-Methylcyclopropene an Oligonukleotiden dar und leistet somit einen wichtigen Beitrag zur Ergänzung des "Werzeugkastens"{ der Chemischen Biologie.
Zur Modifizierung von z.B.: Nukleinsäuren stehen verschiedene postsynthetische Reaktionen zur Verfügung, wobei in dieser Arbeit, insbesondere auf die Diels-Alder-Reaktion mit inversem Elektronenbedarf (iEDDA) Wert gelegt wird. Besonders die Verwendung von 1-Methylcyclopropenen als reaktive Sonde stellt eine hervorragende Methode zur schnellen und zugleich bioorthogonalen Markierung dar. Diese werden im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit enzymatisch in Oligonukleotide eingebaut und deren Reaktivität mit tetrazinmodifizierten Fluoreszenzfarbstoffen demonstriert. Anschließend werden diese cyclopropenmodifizierten DNA-Stränge zur Untersuchung von Brustkrebszellen (HeLa) genutzt.
Diese Arbeit stellt einige der ersten Anwendungen der 1-Methylcyclopropene an Oligonukleotiden dar und leistet somit einen wichtigen Beitrag zur Ergänzung des "Werzeugkastens"{ der Chemischen Biologie.
Inhaltsverzeichnis
- BEGINN
- 1. Einleitung
- 2. Themenstellung
- 3. Theoretischer Hintergrund
- 3.1 Bioorthogonalität
- 3.2 Bioorthogonale Markierungsmethoden
- 3.3 Kupferfreie postsynthetische Markierungsmethoden
- 3.3.1 Ringspannungsgesteuerte Azid†Alkin†Cycloaddition (SPAAC)
- 3.3.2 „Photoclick“†Reaktion
- 3.3.3 Diels†Alder Cycloaddition mit inversem Elektronenbedarf (iEDDA)
- 3.4 Cyclopropene zur postsynthetischen Markierung
- 3.5 Metabolische Markierung von DNA
- 3.6 Enzymatische Methoden zur DNA†Synthese
- 4. Hauptteil
- 4.1 Teil I: 1-MCP-modifizierte Nukleoside zur bioorthogonalen Markierung von DNA
- 4.1.1 Untersuchungen 1†methylcyclopropenmodifizierter Uridin†Derivate
- 4.1.2 1†MCP†modifiziertes 7†Deaza†dATP als orthogonaler Baustein
- 4.1.3 Mehrfachmodifikationen eines DNA†Strangs
- 4.1.4 In†vivo†Zellexperimente
- 4.2 Teil II: Nukleoside mit möglichst kleiner Cyclopropenmodifikation
- 4.2.1 Synthesestrategie zum Nukleosid 30
- 4.2.2 Synthese des direktverknüpften Nukleosid†Triphosphats 3
- 4.2.3 Einbau des minimalmodifizierten dUTPs 3 mittels PEX und iEDDA
- 4.3 Teil III: 3†Methylcyclopropen zur photoinduzierten Markierung von DNA
- 4.3.1 Synthese des 3†MCP†modifizierten dUTP 4
- 4.3.2 Enzymatischer Einbau des „Photoclick“†Bausteins 4
- 4.3.3 Markierung der 3†MCP†modifizierten DNA
- 5. Zusammenfassung und Ausblick
- 6. Experimenteller Teil
- 6.1 Verwendete Chemikalien und Geräte
- 6.1.1 Analytik
- 6.1.2 Reagenzien und Präparatives Arbeiten
- 6.1.3 Spektroskopische Methoden
- 6.1.4 Primerverlängerung und DNA†Markierung
- 6.2 Synthesevorschriften und Analytik
- 6.3 Enzymatische DNA†Synthese
- 6.3.1 Artifizielle Nukleosid†Triphosphate
- 6.3.2 Durchführung der Primerverlängerung
- 6.3.3 Postsynthetische DNA†Markierung
- 6.4 In vivo†Zellexperimente
- 6.5 Anhang
- 7. Abkürzungsverzeichnis
- 8. Literaturverzeichnis
- 9. Appendix
- 10. Ehrenwörtliche Erklärung